使用机械或化学方法提取生物样本中的蛋白质， 定量总蛋白，样品与缓冲液混合，然后装在凝胶上进行电泳。
注意事项：
> 蛋白质在样品处理过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
> 样品建议分装成合适的量（比如分装出 20μL 检测蛋白质定量用），然后 -20°或 -80℃中长期保存，注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。
> 切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。
2.SDS PAGE 电泳
蛋白样品被装载到凝胶上，通过电泳将它们按大小分开。
注意事项：
> 配胶试剂里面的 AP 需要根据实验室实际温度来适量的增加或者减少，比如夏天温度较高, 自然凝胶速度较快，AP 的量需要适当的减少；冬天温度低，凝胶慢，需要适量的增加。
> 灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。加水液封时速度要很慢，否则胶会被冲变形。
> 所有的蛋白样品定量一致，体积一致，不够的用裂解液补足，样品两侧的泳道用等体积 的1×Loading Buffer 上样，Marker也用1×Loading Buffer调制与样品等体积，这样可以避免出现误差。
> 加样前可用 5mL 注射器或加样器先冲洗一下加样孔。加入下一个样品前，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
> 电泳时间和电压说法各异。一般电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。
3.蛋白转膜
将蛋白从凝胶基质移动到合成膜支持物上，并与膜相结合，形成印迹。
注意事项：
> 选择合适的膜和缓冲液是确保蛋白转印成功的关键。必须通盘考虑蛋白质的大小和电荷、转印方法和膜 的结合特性。
> 切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1min~2min。
> 在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的 PVDF 膜和滤纸，平衡 10min左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。
> 用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。
> 用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干。这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率。
4.封闭
对转印后的膜进行封闭，阻断膜上未结合位点，以防止与抗体的非特异性结合。
注意事项:
> 做磷酸化蛋白的western时使用BSA（牛血清蛋白）作为封闭液。奶粉含有酪蛋白（一种磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出现背景深的现象。并且脱脂奶粉含磷酸酶，磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白时会受到影响。
5.抗体孵育
膜首先与一种特异性针对目标蛋白上一个抗原表位的初级抗体孵育。经过几次洗涤后，随后会与一个标记的二级抗体孵育，以提供检测的手段。
注意事项：
> 为减少非特异结合,可选用封闭液作为一抗和二抗的抗体稀释液。
> 一抗孵育条件推荐 4°C过夜, 二抗孵育条件为室温,1h。
> 洗涤液推荐选用 TBST 缓冲液。洗涤时应保持适中的摇床速度,避免过快导致膜上的蛋白 或抗体脱落,同时确保洗涤液能够充分接触到膜上的每一个角落。在洗涤过程中,适时更换 新的洗涤液以确保洗涤效果。
> 洗涤过程中需要保持膜的湿润,避免膜干燥导致抗体结合力下降或蛋白变性。
6.发光显影
将膜清洗以移除未结合的抗体后，使用二抗上的标签来可视化感兴趣的蛋白。抗体可以标记有产生颜色和光的酶，或者直接用荧光标记来可视化蛋白。
注意事项：
> 采用暗室胶片曝光方法，操作需要尽量熟练，除了要把握曝光时间，还要避免位移（压片、取片过程中胶片和杂交膜不能有移动）；保留好胶片，作为原始凭证；
> 使用化学发光成像仪采集图像，注意采集白光下的图像，并与发光的图像进行融合，作为原始凭证保存。
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